Тест ИФА выявляет множество заболеваний, поэтому он нашел широкое применение в медицине и не только. Тем не менее, тест ELISA наиболее известен как метод, используемый для диагностики болезни Лайма. Что такое ИФА-тест? Как интерпретировать результаты? Сколько стоит тест?
ИФА, т.е. иммуноферментный анализ, является широко используемым лабораторным методом, который используется, в том числе, для для количественного определения антител в крови.
ПоэтомуИФАнашелприменениев диагностике бактериальных заболеваний, таких какболезнь Лайма из Лайма.
Преимуществом метода ИФА является его простота и возможность быстрого выполнения, а также высокая чувствительность. Метод ИФА проводится с использованием специальных пластиковых планшетов с лунками, заполненными, например, белками (антигенами) спирохеты боррелий и специфическими моноклональными антителами, которые предназначены для выявления антител в образце пациента.
ИФА - что он выявляет? Использование ИФА
Высокая чувствительность и простота метода ИФА сделали его полезным для диагностики многих заболеваний, но наиболее известен он как метод диагностики Лайм-боррелиоза.
В случае диагностики Лайм-боррелиоза проводится так называемая непрямой ИФА, который позволяет обнаружить специфические IgM или IgG в исследуемом материале. Точно так же антитела могут быть обнаружены в диагностических целях:
- вирусные инфекции: вирусы герпеса (вирус герпеса, опоясывающего лишая, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус), ВИЧ, вирусы гепатита (HBV и HCV)
- протозойные инфекции: токсоплазмоз, лямблиоз
- аутоиммунные заболевания: глютеновая болезнь (анти-тТГ или анти-ДФГ антитела), болезнь Хашимото (анти-ТГ и анти-ТПО антитела), воспалительные заболевания кишечника (анти-АСКА и анти-АНЦА антитела)
- паразитарные заболевания и аллергии, при которых выявляются специфические антитела IgE. Их повышенный уровень может указывать на аллергию, например, на пыльцу и продукты питания, или на паразитарную инвазию (солитер, аскариды человека)
Существуют также модификации метода ИФА (так называемый сэндвич-ИФА), которые позволяют обнаруживать в исследуемом образце белки, отличные от антител. Тогда целью теста является обнаружение в биологическом материале:
- фрагменты вирусов или бактерий, чаще всего это антигены, специфичные для данного возбудителя
- гормоны сыворотки, например эстрогены, пролактин, ТТГ, fT4, кортизол
- ферменты, например кальпротектин, панкреатическая эластаза, щелочная фосфатаза
- раковые маркеры, например CA-125
- наличие наркотиков в сыворотке крови
Этот метод также применим в пищевой промышленности, где могут быть обнаружены следовые количества аллергенов (например, молока, арахиса), ГМО или токсинов в пищевых продуктах.
Тест ИФА - о чем этот тест?
Диагностика, например, Лайм-боррелиоза методом ИФА заключается в обнаружении в биологическом материале иммунных белков - антител, образующихся при ответе на антигены боррелий.
Антитела тестируются на два класса IgM и IgG. IgM - это первые антитела, которые появляются в организме после контакта с бактерией и со временем исчезают.
Их заменяют более стойкие антитела IgG, способные сохраняться в организме несколько десятков лет.
Таким образом, присутствие бактерий в организме косвенно проверяется путем обнаружения антител, направленных конкретно против спирохет Borrelia.
Антитела на разных стадиях инфекции могут быть направлены против различных белков спирохет Borrelia. Например, на ранней стадии это p41.
На более поздних стадиях белков все больше и больше начинают проявляться как p21, p30, p39, p43. Вот почему диагностика клещевого боррелиоза крайне затруднена.
Выбор бактериальных белков чрезвычайно важен для того, чтобы тест обладал высокой диагностической ценностью. Поэтому при диагностике Лайм-боррелиоза следует рутинно использовать ИФА-тесты II или III поколения, в которых наборы белков подобраны таким образом, чтобы получить наиболее достоверный результат.
ИФА и болезнь Лайма. Когда выступать?
Болезнь Лайма - это бактериальное заболевание, вызываемое бактериями Borrelia burgdorferi и ее многочисленными вариантами.
Диагностика заболевания затруднена из-за сложности иммунного ответа против спирохет Borrelia и несовершенства лабораторных методов.
Наиболее широко используемым лабораторным методом является высокочувствительный ИФА, который выявляет специфические антитела, вырабатываемые против бактериальных белков.
Для диагностики Лайм-боррелиоза используется непрямой метод ИФА, в котором выделяют следующие стадии:
- инкубация лунок на планшете с материалом, взятым у больного, например, сывороткой. Если в тестируемом материале есть антитела против спирохет Borrelia, они прикрепляются к белкам на дне реакционной лунки
- затем излишки сыворотки вымываются специальной промывочной жидкостью (буфером) и т.н. конъюгат, то есть связанное с ферментом антитело, которое соединяется с ранее связанными антителами в реакционных лунках
- затем добавляется субстрат для конъюгата и происходит цветная реакция (положительная) или нет цветной реакции (отрицательная)
- последний этап - считывание с помощью ридера (спектрофотометра) концентрации антител против спирохет Borrelia в сыворотке крови больного
ИФА на Лайм-боррелиоз проводят на крови, а при наличии неврологической симптоматики (нейроборрелиоз) - и на спинномозговой жидкости.
Синовиальную жидкость не следует тестировать, так как высока вероятность ложноположительных результатов.
Основой для диагностики заболевания являются клинические симптомы, указывающие на него, подтвержденные результатом лабораторных исследований.
Добавленный лабораторный результат без симптомов не ставит диагноз боррелиоза Лайма, поскольку было показано, что антитела к боррелиозу Лайма также обнаруживаются у здоровых людей.
Серологическая диагностика Лайм-боррелиоза начинается с полуколичественного скринингового теста ELISA. Если результат отрицательный, либо спирохеты Borrelia не обнаружены, либо результат ложноотрицательный.
В случае положительного или слабоположительного (неубедительного) следует провести подтверждающий тест методом вестерн-блоттинга, обладающего высокой специфичностью.
Это делается для подтверждения «правдивости» результатов, полученных с помощью ИФА. При постановке диагноза нельзя пропускать ни один из вышеперечисленных этапов и, например, сразу проводить диагностику методом вестерн-блоттинга или ставить диагноз на основании положительного результата методом ИФА.
В Польше диагностика Лайм-боррелиоза очень часто заканчивается на первом этапе скрининга, что вызывает неправильную интерпретацию положительных или слабоположительных результатов.
Полезно знать
ИФА-тест - цена. Сколько стоит ИФА-тест?
Тест стоит около 60 злотых и делается сразу. С другой стороны, результатов реферала можно ждать около трех месяцев.
ИФА - результаты. Могут ли они быть ложными срабатываниями?
Ложноположительные результаты являются результатом перекрестной реактивности большинства антител IgM с другими белками. Антитела, вырабатываемые организмом, могут «неправильно» распознавать антиген других микроорганизмов как антиген боррелий.
Наиболее частые «ошибки» возникают у людей, инфицированных бледной спирохетой (лат. Treponema pallidum), герпесвирусами, а также у людей с системной красной волчанкой и другими ревматическими заболеваниями.
ИФА - результаты. Могут ли они быть ложноотрицательными?
Ложноотрицательные результаты могут быть на ранних стадиях заражения, тогда тест следует повторить примерно через 3-4 недели. Это так называемый серологическое окно, т.е. начальный период инфекции, при котором организм еще не успел выработать специфические антитела.
Подобно людям с иммунодефицитом, у которых не вырабатывается достаточно антител.
Большой проблемой, особенно при очень интенсивных инфекциях, является появление т.н. иммунные комплексы, состоящие из антигенов спирохет Borrelia и специфичных к ним антител.
Это делает антитела «невидимыми» для широко используемых методов, таких как ИФА, и, хотя они присутствуют в тестируемом материале, их невозможно обнаружить.
В таких случаях лаборатория может использовать разрушение иммунного комплекса. Это лечение направлено на высвобождение антител. Однако этот метод не получил широкого распространения из-за отсутствия стандартизации в лабораториях.
Почему диагностика Лайм-боррелиоза непроста?
Это связано со сложностью иммунного ответа против боррелий и ограничениями лабораторных методов. Разнообразие разновидностей и появление новых инфекций, особенно на европейском континенте, не способствует разработке эффективных методов диагностики.
В последнее время в Европе появилось больше разновидностей, таких как Borrelia bissetii, Borrelia valaisiana и Borrelia spielmanii. Кроме того, в организме спирохеты боррелий могут превращаться в кисту или находиться в местах тела, недоступных для клеток иммунной системы.
Оставаясь таким образом «невидимым» для иммунной системы. Кроме того, показано, что в тканях могут присутствовать фрагменты бактерий, обладающих выраженными провоспалительными свойствами. Считается, что они могут быть ответственны за хронические симптомы клещевого боррелиоза, несмотря на отрицательные результаты лабораторных анализов.
Литература
1. Witecka-Knysz E. и др. Болезнь Лайма: почему диагностика так сложна? Лаборант-диагност апрель 2007.2. Мур А. и др. Текущие рекомендации, распространенные клинические ошибки и будущие направления лабораторной диагностики болезни Лайма, США. Эмердж Инфекция Дис. 2016 июль; 22(7).3. Лабораторная диагностика клещевых заболеваний Рекомендации Рабочей группы: Национальная палата лабораторных диагностов, Национальный институт общественного здравоохранения - Национальный институт гигиены, Национальный консультант в области инфекционных заболеваний, Кафедра инфекционных болезней и нейроинфекций, Белостокский медицинский университет, Польское вирусологическое общество, Варшава, 20144. Hosseini S. et al.: Иммуноферментный анализ (ИФА) от А до Я. Springer 2017.