ПЦР - это тест, который используется для диагностики многих заболеваний. Метод ПЦР позволяет продемонстрировать непосредственное присутствие бактерии в организме, в частности ее ДНК. ПЦР-тестирование используется, например. в диагностике болезни Лайма. Что такое метод ПЦР? Что такое ПЦР в реальном времени?
ПЦР (полимеразная цепная реакция) - основной метод, используемый в генетических и молекулярных лабораториях. Он был разработан в 1983 году Кэри Маллисом, получившим за него Нобелевскую премию в 1993 году.
ПЦР (исследование) - что такое метод ПЦР?
ПЦР-тест заключается в многократной амплификации (обычно в 30-40 циклов) определенного фрагмента ДНК, например, генов, кодирующих белки боррелий, с использованием фермента полимеразы.
Затем используются специальные молекулярные красители, чтобы сделать амплифицированный фрагмент ДНК видимым. ПЦР, благодаря дублированию специфических фрагментов ДНК, является сверхчувствительным методом.
В методе ПЦР фрагменты ДНК размножаются с использованием определенных пар праймеров для данного участка бактериальной ДНК. Например, области-мишени в методе ПЦР, используемом для диагностики Лайм-боррелиоза, представляют собой гены, кодирующие белки, т.е. 16S рДНК, recA, fla, p66, OspA
Биологический материал, который можно протестировать:
- кровь
- срез кожи при мигрирующей эритеме
- спинномозговая жидкость
- синовиальная или хрящевая жидкость
- моча
ПЦР (тест) - применение метода ПЦР
Помимо диагностики Лайм-боррелиоза, метод ПЦР позволяет обнаруживать специфические фрагменты ДНК других микроорганизмов или человека. Поэтому метод ПЦР также используется в:
- диагностика и мониторинг вирусных инфекций: герпесвирусы (вирус герпеса, опоясывающего лишая, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус), ВИЧ, вирусы гепатита (HBV и HCV)
- диагностика и мониторинг бактериальных инфекций, особенно тех бактерий, которые не могут быть идентифицированы с помощью посева, например туберкулеза
- диагностика и мониторинг онкологических заболеваний: лейкемия, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких
- диагностика предрасположенности к раку: рак груди и яичников (гены BRCA1 и BRCA2), колоректальный рак (гены APC и CHEK2)
- диагностика генетических заболеваний: гемохроматоз (ген HFE), талассемия (гены HBA1 и HBA2), целиакия (гены HLA)
- тесты на отцовство, которые соответствуют ДНК ребенка и отца
Полезно знать
В настоящее время существует множество модификаций метода ПЦР. Например, для диагностики Лайм-боррелиоза в основном используют вложенную ПЦР иПЦР в реальном времени. Последний метод является количественным и позволяет определить точное количество копий ДНК спирохет Borrelia в тестируемом биологическом материале.
ПЦР (тест) и болезнь Лайма
Диагноз Лайм-боррелиоза основывается на серологических тестах. Однако существуют клинические ситуации, при которых эти тесты могут быть ложноотрицательными:
- серологическое окно, т.е. начальный период инфекции, при котором организм еще не вырабатывает специфические антитела IgM и IgG к спирохетам боррелий
- люди с иммунодефицитом, у которых недостаточно вырабатываются антитела
- наличие иммунных комплексов, состоящих из антигенов спирохет боррелий и специфичных к ним антител, препятствующих выявлению антител серологическими методами
При подозрении на симптомы Лайм-боррелиоза у пациента и отрицательных результатах серологического исследования можно провести молекулярный тест на основе ПЦР.
ДНК спирохет боррелий можно обнаружить на ранних стадиях инфекции, так как в это время количество спирохет в биологических жидкостях максимально.
Для диагностики Лайм-боррелиоза в основном используются серологические методы, такие как ИФА, но в некоторых клинических ситуациях полезны генетические тесты с использованием метода ПЦР
Чем дольше время от заражения, тем меньше вероятность обнаружения ДНК бактерий. Поэтому в некоторых случаях перед проведением ПЦР-теста бактерии выращивают на специальных средах в течение 1-2 недель, а затем проводят тест.
Этот подход используется при подозрении на нейроборрелиоз и заборе спинномозговой жидкости. В поздней фазе инфекции более подходящим является ИФА.
Метод ПЦР не следует использовать в рутинной диагностике боррелиоза Лайма из-за отсутствия стандартизации в отношении встречаемости разновидностей Borrelia burgdorferi в Польше.
Однако в случае затруднений в диагностике (особенно на ранней стадии заболевания) в диагностическом процессе помогает результат ПЦР-теста.
Положительный результат теста означает, что в исследуемом материале обнаружено присутствие ДНК Borrelia burgdorferi и ее вариантов, но не объясняет наличие в организме активной инфекции. С другой стороны, отрицательный результат не исключает наличия бактерий в организме.
Некоторые лаборатории предлагают анализ ДНК боррелий в клеще. Однако результат такой пробы не является основанием для диагностики Лайм-боррелиоза у укушенного человека.
ПЦР - результаты. Могут ли они быть ложными срабатываниями?
ПЦР является сверхчувствительным методом и в то же время очень чувствительным к контаминации. Поэтому в тестах на основе ПЦР очень важно выбрать правильный внутренний контроль, чтобы исключить ложноположительные результаты.
Важно также правильно собрать материал для исследования, а также опыт и надежность диагноста, проводящего исследование.
ПЦР - результаты. Могут ли они быть ложноотрицательными
Как и в любом лабораторном тесте, метод ПЦР также может давать ложноотрицательные результаты. Здесь крайне важно взять кровь на соответствующий антикоагулянт, поскольку некоторые из них, например гепарин, могут ингибировать ПЦР-реакцию.
Кроме того, забор проб после начала антибактериальной терапии может привести к снижению эффективности ПЦР и повышению вероятности ложноотрицательных результатов.
Также следует учитывать, что бактерии боррелии очень недолго живут в крови и жидкостях организма, так как благодаря специальным рецепторам очень быстро проникают в «труднодоступные» места в организме.
Поэтому, в отличие от диагностики других микроорганизмов, количество спирохет Borrelia в биологическом материале невелико, иногда даже на пределе обнаружения метода ПЦР. Это также может привести к ложноотрицательным результатам.
Литература
- Dunaj J. и др. Значение метода ПЦР в диагностике Лайм-боррелиоза. Просматривать эпидемия. 2013, 67, 119 - 123.
- Лабораторная диагностика клещевых заболеваний Рекомендации Рабочей группы: Национальная палата лабораторных диагностов, Национальный институт общественного здоровья - Национальный институт гигиены, Национальный консультант в области инфекционных болезней, Отделение инфекционных болезней и нейроинфекций, Медицинский университет Белостока, Польское вирусологическое общество, Варшава, 2014 г..
- Ружич-Саблич Э. и Серар Т. Прогресс в молекулярной диагностике болезни Лайма. Эксперт Rev Mol Diagn. 2017 янв;17(1):19-30.
- Валонес М. А. А. и др. Принципы и применение полимеразной цепной реакции в области медицинской диагностики: обзор. Браз Дж Микробиол. январь-март 2009 г.; 40(1): 1-11.